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本制品是通过大肠杆菌表达、纯化获得的可用于催化无机焦磷酸盐(PPi)水解为正磷酸盐(Orthophosphate)的高品质重组酶。


多种代谢反应会产生无机焦磷酸，酵母无机焦磷酸酶可水解无机焦磷酸盐，从而可以避免无机焦磷酸对反应的抑制，促使反应向正向进行，从而常用于RNA体外转录、DNA复制和扩增如HDA或LAMP等温扩增等产生无机焦磷酸反应体系中促进正向反应，提高反应产物的产量。


酵母无机焦磷酸酶是一种金属蛋白酶(Metalloprotease)，其催化的反应如下。该酶的活性受二价金属离子的影响，Mg²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺均可以提高其催化活性，在Mg²⁺存在的条件下活性最高。

• 体外转录反应中，可提高RNA的合成量；
  
• DNA聚合反应中，防止无机焦磷酸盐积累；
  
• 利用焦磷酸盐测定法进行SNP基因分型的试剂中去除焦磷酸污染。

由大肠杆菌表达，表达基因为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ppa基因。


一个活性单位是指在500μL反应体系中，25℃条件下，催化无机焦磷酸盐每分钟产生1μmol磷酸盐所需的酶量。
反应缓冲液：100mM Tris-HCl (pH7.2),2mM MgCl₂ and 2mM PPi。

组分	10U	50U	200U	1000U
酵母无机焦磷酸酶(0.1U/μL)	100μL	500μL	-	-
10×Reaction Buffer	100μL	500μL	-	-
Storage (Dilution) Buffer	1mL	5mL	-	-
100mM Na4P2O7	100μL	100μL	-	-
酵母无机焦磷酸酶(1U/μL)	-	-	200μL	1mL
说明书	1份

保存：-20℃，有效期2年。

• Storage (Dilution) Buffer：
  20mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，50% (v/v) glycerol。
  
• 10×Reaction Buffer:
  1M Tris-HCl(pH7.2)，20mM MgCl₂。

不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。


酵母无机焦磷酸酶的活性可以被EDTA强烈抑制；亚胺二磷酸盐(Imidodiphosphate)、α,ω-glycol disphosphates、methanedial diphosphate和1,2-ethanedial diphosphate也是酵母无机焦磷酸酶的抑制剂。加热不能使该酶完全失活，可通过柱纯化或酚/氯仿抽提的方法去除酵母无机焦磷酸酶。

• 本制品对焦磷酸钠的水解效果请参考图2。
  
  图2.酵母无机焦磷酸酶(货号：YTB4625)与国外N公司的Yeast Inorganic Pyrophosphatase，对焦磷酸钠的水解效果对比图。利用磷酸盐检测试剂盒检测焦磷酸钠水解所产生的磷酸，将百奥莱博与N公司的酵母无机焦磷酸酶(0.1U/μL)分别稀释400、500、667、1000、2000倍，然后配制100μL反应体系：100mM Tris-HCl (pH7.2),2mM MgCl₂,0.1mM焦磷酸钠，1μL上述不同稀释度的酵母无机焦磷酸酶或Storage (Dilution) Buffer，25℃孵育10分钟。样品孵育期间，将5mM磷酸盐标准品用双蒸水稀释至0、2.5、5、10、20、30、40、50μM。将Malachite Green Reagent A和Malachite Green Reagent B按照体积比2:1混合(现配现用)，即为显色剂。96孔板每孔中加入200μL不同浓度的磷酸盐标准品或样品(100μL反应液+100μL水)，每孔加入70μL显色剂，用移液器轻轻吹打混匀，室温静置30分钟，用酶标仪测定波长630nm的吸光度。根据磷酸盐标准品的浓度和A630数值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样品中所产生的磷酸根浓度，进而计算磷酸根的生成速率。酵母无机焦磷酸酶的测活数据来自三次独立重复实验。本制品与N公司的竞品相比，对焦磷酸钠具有基本一致的水解效果。图中数据仅供参考，不同实验条件下获得的数据会有一定的差异。
  
• 本制品对体外转录的影响请参考图3。
  
  图3.酵母无机焦磷酸酶对体外转录的影响。利用T7快速体外转录试剂盒进行RNA体外转录。配制20μL反应体系：7μL Nuclease-free Water,1.5μL 10×T7 Reaction Buffer (终浓度为0.75×),6μL NTP Mix,2μL Template DNA (终浓度为0.05μg/mL),0.5μL RNase Inhibitor,2μL T7 RNA Polymerase,1μL酵母无机焦磷酸酶或Storage Buffer (酶量为0U,0.001U,0.01U,0.1U,0.3U,0.5U)。37℃孵育2.5小时，然后向反应体系中加入80μL Nuclease-free Water和1μL DNase I，混匀后37℃孵育15分钟，使模板DNA降解。取90μL反应液，与90μL Nuclease-free Water和20μL 3M NaAC混匀，再加入200μL苯酚/氯仿混合液(苯酚：氯仿=1:1)，充分混匀，4℃,12000rpm离心15分钟。将上清与2.5倍体积的无水乙醇混合，-80℃沉淀过夜，使RNA析出。4℃,12000rpm离心20分钟，弃上清，用500μL 70%乙醇洗涤沉淀一次，晾干，使乙醇挥发。用50μL Nuclease-free Water溶解沉淀。将15μL甲醛、4μL loading和2μL样品混合，70℃加热10分钟后进行跑胶。得到的RNA转录产物的长度为175nt。实验发现，加入酵母无机焦磷酸酶后，转录产物的量约为对照组的2～3倍。

• 酵母无机焦磷酸酶在很多反应体系中有反应活性，很多时候可以直接添加到反应体系中即可有效去除反应产生的焦磷酸，促进正向反应的进行并提高反应产物的产量。
  • 保证反应体系中含有适量的镁离子可以确保酵母无机焦磷酸酶具有很高的活性。酵母无机焦磷酸酶比较理想的反应温度是25℃，但在16～37℃均有较好的酶活性。具体在不同反应体系中的用量，需要适当摸索和优化，通常可以在0.05～1U/mL浓度范围内进行调整。比较理想的反应条件请参考相关文献资料进行。Storage (Dilution) Buffer可以用于酵母无机焦磷酸酶的稀释和保存。
• 焦磷酸盐的水解：
  
  • 用超纯水将100mM Na4P2O7稀释至10mM，并参考下表在冰浴中配制如下反应体系。
    

    成分	对照品		样品
    	用量	终浓度	用量	终浓度
    超纯水	89μL	-	88μL	-
    10×Reaction Buffer	10μL	1×	10μL	1×
    10mM Na4P2O7	1μL	0.1mM	1μL	0.1mM
    酵母无机焦磷酸酶(Diluted)	-	-	1μL	0.5-2.5mU/mL
    总体积	100μL	-	100μL	-

  • 反应条件：25℃孵育10分钟。
    • 可适当延长孵育时间，提高水解效果。
  • 用超纯水将5mM磷酸盐标准品稀释至50μM，并参考下表将50μM磷酸盐(Pi)标准品进一步稀释至不同浓度。
    

    Pi(μM)	0	2.5	5	10	20	30	40	50
    50μM Pi(μL)	0	10	20	40	80	120	160	200
    超纯水(μL)	200	190	180	160	120	80	40	0
    总体积(μL)	200	200	200	200	200	200	200	200

    
    
  • 96孔板每孔中加入200μL不同浓度的磷酸盐标准品或上述步骤2b的反应产物(100μL反应液+100μL水)。
    
  • 使用磷酸盐检测试剂盒检测磷酸根的生成量。

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